植物組培的操作技術(shù)：初代培養-上海農卉生物科技有限公司

植物組培的操作技術(shù)：初代培養

　　培養指把培養材料放在培養室（有光照、溫度條件）里，使之生長(cháng)，分裂、分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過(guò)程。

　　（一）培養方法1．固體培養法即用瓊脂固化培養基來(lái)培養植物材料的方法。是現在常用的方法。該法設備簡(jiǎn)單，易行。但養分分布不均，生長(cháng)速度不均衡。并常有褐化中毒現象發(fā)生。

　　2．液體培養法即用不加固化劑的液體培養基培養植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，常需要通過(guò)攪動(dòng)或振動(dòng)培養液的方法以確保氧氣的供給，采用往復式搖床或旋轉式搖床進(jìn)行培養，其速度一般為50～100轉／min，這種定期浸沒(méi)的方法，既能使培養基均一，又能保證氧氣的供給。

　　（二）培養步驟1．初代培養即接種某種外植體后，初的幾代培養。初代培養旨在獲得無(wú)菌材料和無(wú)性繁殖系。初代培養時(shí)，常用誘導或分化培養基，即培養基中含有較多的細胞分裂素和少量的生長(cháng)素。初代培養建立的無(wú)性繁殖系包括莖梢、芽叢、胚狀體和球莖等。根據初代培養時(shí)發(fā)育的方向可分為：（1）頂芽和腋芽的發(fā)育采用外源的細胞分裂素，可促使具有頂芽或沒(méi)有腋芽的休眠側芽啟動(dòng)生長(cháng)。形成一個(gè)微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結構。在幾個(gè)月內可以將這種叢生苗的一個(gè)枝條轉接繼代，重復芽－苗增殖的培養，從而迅速獲得多數的嫩莖。然后將一部份嫩莖轉移到生根培養基上，就能得到可種植到土壤中去的完整的小植株。一些木本植物和少數草本植物可以通過(guò)這種方式來(lái)進(jìn)行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。這種繁殖方式也稱(chēng)作微型扦插，它不經(jīng)過(guò)發(fā)生愈傷組織而再生，是能使無(wú)性系后代保持品種特性的一種繁殖方式。

　　適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時(shí)，只能采用頂芽、側芽或帶有芽的莖切段，其它如種子萌發(fā)后取枝條也可以。

　　莖尖培養可看作是這方面較為特殊的一種方式。它采用其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進(jìn)行接種。在實(shí)際操作中。采用包括莖尖分生組織在內的一些組織來(lái)培養，這是為了操作方便以及容易成活。

　　用靠培養定芽得到的培養物一般是莖節較長(cháng)，有直立向上的莖梢，擴繁時(shí)主要用切割莖段法，如香石竹、矮牽牛、菊花等。但特殊情況下也會(huì )生出不定芽，形成芽叢。

　　（2）不定芽的發(fā)育在培養中由外植體產(chǎn)生不定芽,通常首先要經(jīng)脫分化過(guò)程,形成愈傷組織的細胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織形成器官基，它在構成器官的縱軸上表現出單向的性（這與胚狀體不同）。多數情況下它先形成芽，后形成根。

　　另一種方式是從器官中直接產(chǎn)生不定芽，有些植物具有從各個(gè)器官上長(cháng)出不定芽的能力如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。當在試管培養的條件下，培養基中提供了營(yíng)養，特別是連續不斷植物激素的供應，使植物形成不定芽的能力被大大地激發(fā)起來(lái)。許多種類(lèi)的外植體表面幾乎全部為不定芽所覆蓋。許多常規方法不能無(wú)性繁殖的種類(lèi)，在試管條件下卻能較容易地產(chǎn)生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物儲藏器官能強烈地發(fā)生不定芽，用百合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。

　　在不定芽培養時(shí)，也常用誘導或分化培養基。用靠培養不定芽得到的培養物，一般采用芽叢進(jìn)行繁殖，如非洲菊、草莓等。

　　（3）體細胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育體細胞胚狀體類(lèi)似于合子胚但又有所不同，它也通過(guò)球形，心形，魚(yú)雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時(shí)期，終發(fā)育成小苗。但它是由體細胞發(fā)生的。胚狀體可以從愈傷組織表面發(fā)生，也可從外植體表面已分化的細胞產(chǎn)生，或從懸浮培養的細胞產(chǎn)生。

　　(4)初代培養外植體的褐變外植體褐變是指在接種后，其表面開(kāi)始變褐，有時(shí)甚至會(huì )使整個(gè)培養基變褐的現象。它的出現是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過(guò)程中，會(huì )產(chǎn)生醌類(lèi)物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當擴散到培養基后，就會(huì )抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養。

　　褐變的主要因如下：（1）花卉品種：研究表明，在不同花卉品種間的褐變現象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差異，因此有些花卉品種的外植體在接種后較易褐變，而有些花卉品種的外植體在接種后不易褐變。故在培養過(guò)程中應該有所選擇，對不同的品種分別進(jìn)行處理。

　　（2）生理狀態(tài)：外植體的生理狀態(tài)不同，在接種后褐變程度也有所不同。一般來(lái)說(shuō)，處于同期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類(lèi)物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴重。一般來(lái)說(shuō)，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴重。

　　（3）培養基成分：濃度過(guò)高的無(wú)機鹽會(huì )使某些觀(guān)賞植物的褐變程度增加，此外，細胞分裂素的水平過(guò)高也會(huì )刺激某些花卉外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現象加深。

　　（4）培養條件不當：例如光照過(guò)強、溫度過(guò)高、培養時(shí)間過(guò)長(cháng)等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養的外植體的褐變程度。

　　為了提高花卉組織培養的成苗率，必須對外植體的褐變現象加以控制。經(jīng)過(guò)眾多研究者的努力，可以采用措施防止、減輕褐變現象的發(fā)生。

　　（1）選擇合適的外植體：一般來(lái)說(shuō)，好選擇生長(cháng)處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現象明顯減輕。

　　（2）合適的培養條件：無(wú)機鹽成分、植物生長(cháng)物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養均可以減輕材料的褐變現象。

　　（3）使用抗氧化劑：在培養基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現象。另外使用0．1％～0．5％的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。

　　（4）連續轉移：對容易褐變的材料可間隔12～24小時(shí)的培養后，再轉移到新的培養基上，這樣經(jīng)過(guò)連續處理7～10天后，褐變現象便會(huì )得到控制或大為減輕。

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